Enzima de restricción y ligasa

Arriba se observa dos segmentos de ADN de diferente origen que estan siendo cortadas por la misma endonucleasa (enzimas de restricción).
Al centro se observa el corte cohesivo de la enzima y como los ADN son asociados por la ligasa.
Abajo se observa la unión de los dos fragmentos de ADN extraños unos con otros.

Plasmidio artificial

Este es un plasmidio (ADN circular) construido artificialmente y hecho a pedido para cumplir ciertas funciones que requiere el cliente. La desventaja de los plasmidios es que pueden alojar como máximo segmentos de ADN inferiores a 10.000 bases (<10kb). Particularmente en este plasmidio se introdujeron dos genes de resistencia a ampicilina y tetraciclina.

Plasmidios bacteriales

Toda bacteria posee su genoma repartido en dos tipos de cromosomas: uno es lineal, en donde están todos los genes vitales para el metabolismo de la célula; el otro es circular, llamado también plasmidio, que no posee genes esenciales para la vida de la célula, pero son útiles en casos que confieren resistencia, es decir, poseen genes cuyo producto permite sobrevivir a antibioticos del medio externo.

Cada plasmidio tiene sitios de inicio de la replicación, sitios de restricción (sitios de corte de enzimas endonucleasas), genes de resistencia a antibioticos tales como a los de Ampicilina, tetraciclina y otros.

Ingeniería Genética

En la foto: Un plasmidio SC101 (izquierda) es cortado con una endonucleasa (enzima de restricción) al igual que el fragmento de ADN de la derecha. Los segmentos cortados son reasociados con los plasmidios y unidos con ligasas, formando el plasmidio quimera o hibrido.

La ingeniería genética consiste en la modificación del ADN de un organismo para producir nuevos genes con nuevas características. Esta tecnología ha revolucionado la medicina, la agricultura, la farmacia, la genetica y las investigaciones básicas en biológía y evolución.

ADN recombinante: Esta es una técnica para combinar segmentos de ADN de distinto origen, permitir nuevas combinaciones de genes mediante su aislamiento e inserción en otro organismo.

Las herramientas son:

1. Enzimas de restricción: Algunas enzimas en bacterias tienen la misión de atacar segmentos de ADN extraño en una bacteria como por ejemplo ADN viral. Estas enzimas hoy son utilizadas como tijeras moleculares que cortan en secuencias específicas. Estos cortes pueden ser cohesivos o romos. A estas enzimas se les conoce como enzimas de restricción (XbaI, Hpat, BamHI,SalI, EcoR1).

2. Enzimas Ligasas: Son enzimas capaces de ligar o unir dos extremos del mismo ADN o de distintos fragmentos de ADN.

3. Vectores: Un vector es un vehículo en el cual se transporta el gen de interés. El vector más común utilizado es el Plasmidio (ADN circular en bacterias). Estos plasmidios se aislan, se le incorporan genes de interes para estudiar y luego se regresan a las bacterias para que por cada replicación también replique el plasmidio con el gen de interés. De esta manera se pueden sintetizar millones de copias del gen.

4. Celulas huesped: Los huesped más comunes usados son algunas bacterias ampliamente conocidas y estudiadas. Estas bacterias sirven como fuente de plasmidios y como receptor de plamidios ajenos con inserciones de genes de interes, de origen bacterial, plantas o humano.

Regulación génica (Caso Operones)

En la foto: Francois Jacob y Jacques Monod

Normalmente no se pierden cromosomas ni ningun gen en las celulas del cuerpo, sin embargo, claramente las celulas musculares, hepáticas, renales y cerebrales son distintas en su forma y función y fabrican diferentes productos. La razón de ello es que sólo parte de la información en los genes se expresa en una determinada célula. Algunos genes son inactivos, otros tienen gran actividad y otros se expresan en distintas ocaciones a lo largo del desarrollo. Por ejemplo en Echerichia coli existen alrededor de 4000 genes, algunos codifican proteínas necesarias para el ciclo de vida (glicolisis), mientras que otros son necesarios para vivir en condiciones especiales de crecimiento (enzima lactasa que degrada la lactosa de la leche).

Normalmente hay dos mecanismos básicos para controlar la actividad metabólica:

a) puede regular la actividad de algunas enzimas (eficiencia)

b) se puede controlar el número de moleculas enzimaticas (cantidad)


Francois Jacob y Jacques Monod en 1961 demostraron la regulación génica y propusieron la existencia del Operon como unidad de regulación de la transcripción.
Una bacteria sometida a un medio con glucosa, incorpora este nutriente para realizar la respiración celular. En ausencia de glucosa y presencia de lactosa en el medio, se incrementa la sintesis de dos enzimas, la lactasa y la beta-galactosidasa. La lactasa rompe la lactosa en glucosa y galactosa, mientras que la beta-galactosidasa transforma la galactosa en glucosa. De esta manera en presencia unicamente de lactosa, la celula se las arregla para producir glucosa para su respiración celular.

Muchos genes se caracterizan por tener una secuencia Operador (O), una secuencia promotora (P) y luego el gen. El operador puede unir una proteína represora que bloquea al promotor. El promotor permite la unión de la enzima RNA polimerasa para permitir la transcripción en el sitio de inicio.

Operon Lactosa (E. coli): La lactosa actúa como molécula inductora, es decir, un sistema apagado se enciende.

a) Ausencia de lactosa y presencia de glucosa en el medio

Sin Lactosa, una proteína Represora se une al operador libremente bloqueando al promotor e impide la unión de la RNA-polimerasa a este sitio, y por lo tanto no se transcriben los genes beta-galactosidasa, permeasa y trasacetilasa, necesarios para tratar a la lactosa.

b) Presencia de Lactosa y ausencia de glucosa en el medio

La permeasa permite el transporte de la lactosa a través de la membrana hacia el citoplasma. Una vez adentro la lactosa se une al represor para cambiar su conformación y lo suelta del sitio operador, desbloqueando así el promotor y permitiendo que la RNA polimerasa se una a este y transcriba los genes beta-galactosidasa, permeasa y transacetilasa. La beta-galactosidasa cumple la función para la cual fue sintetizada, transformar la galactosa en glucosa.

Operon Triptofano (Salmonella tiphi). El triptofano es una molecula represible, es decir, un sistea encendido lo apaga.

a) En presencia de Triptofano (co-represor), este aminoácido se une a una proteína represora inactiva y la convierte en activa. El represor y el co-represor se unen a su sitio operador y bloquean el promotor, impidiendo la unión de la RNA polimerasa e impidiendo además la transcripción de 5 genes de este Operón.

b) En ausencia de Triptofano, el represor queda inactivo y los 5 genes se transcriben normalmente por la RNA polimerasa.