Equipo de electroforesis: la proteína o el ADN se agrega en un pocillo y con un campo eléctrico se separan las hebras según su tamaño o peso molecular.

jueves, 6 de agosto de 2009

Enzima de restricción y ligasa

Arriba se observa dos segmentos de ADN de diferente origen que estan siendo cortadas por la misma endonucleasa (enzimas de restricción).
Al centro se observa el corte cohesivo de la enzima y como los ADN son asociados por la ligasa.
Abajo se observa la unión de los dos fragmentos de ADN extraños unos con otros.

Plasmidio artificial



Este es un plasmidio (ADN circular) construido artificialmente y hecho a pedido para cumplir ciertas funciones que requiere el cliente. La desventaja de los plasmidios es que pueden alojar como máximo segmentos de ADN inferiores a 10.000 bases (<10kb). Particularmente en este plasmidio se introdujeron dos genes de resistencia a ampicilina y tetraciclina.

Plasmidios bacteriales

Toda bacteria posee su genoma repartido en dos tipos de cromosomas: uno es lineal, en donde están todos los genes vitales para el metabolismo de la célula; el otro es circular, llamado también plasmidio, que no posee genes esenciales para la vida de la célula, pero son útiles en casos que confieren resistencia, es decir, poseen genes cuyo producto permite sobrevivir a antibioticos del medio externo.

Cada plasmidio tiene sitios de inicio de la replicación, sitios de restricción (sitios de corte de enzimas endonucleasas), genes de resistencia a antibioticos tales como a los de Ampicilina, tetraciclina y otros.

Ingeniería Genética


En la foto: Un plasmidio SC101 (izquierda) es cortado con una endonucleasa (enzima de restricción) al igual que el fragmento de ADN de la derecha. Los segmentos cortados son reasociados con los plasmidios y unidos con ligasas, formando el plasmidio quimera o hibrido.

La ingeniería genética consiste en la modificación del ADN de un organismo para producir nuevos genes con nuevas características. Esta tecnología ha revolucionado la medicina, la agricultura, la farmacia, la genetica y las investigaciones básicas en biológía y evolución.

ADN recombinante: Esta es una técnica para combinar segmentos de ADN de distinto origen, permitir nuevas combinaciones de genes mediante su aislamiento e inserción en otro organismo.

Las herramientas son:

1. Enzimas de restricción: Algunas enzimas en bacterias tienen la misión de atacar segmentos de ADN extraño en una bacteria como por ejemplo ADN viral. Estas enzimas hoy son utilizadas como tijeras moleculares que cortan en secuencias específicas. Estos cortes pueden ser cohesivos o romos. A estas enzimas se les conoce como enzimas de restricción (XbaI, Hpat, BamHI,SalI, EcoR1).

2. Enzimas Ligasas: Son enzimas capaces de ligar o unir dos extremos del mismo ADN o de distintos fragmentos de ADN.

3. Vectores: Un vector es un vehículo en el cual se transporta el gen de interés. El vector más común utilizado es el Plasmidio (ADN circular en bacterias). Estos plasmidios se aislan, se le incorporan genes de interes para estudiar y luego se regresan a las bacterias para que por cada replicación también replique el plasmidio con el gen de interés. De esta manera se pueden sintetizar millones de copias del gen.

4. Celulas huesped: Los huesped más comunes usados son algunas bacterias ampliamente conocidas y estudiadas. Estas bacterias sirven como fuente de plasmidios y como receptor de plamidios ajenos con inserciones de genes de interes, de origen bacterial, plantas o humano.

Regulación génica (Caso Operones)

En la foto: Francois Jacob y Jacques Monod

Normalmente no se pierden cromosomas ni ningun gen en las celulas del cuerpo, sin embargo, claramente las celulas musculares, hepáticas, renales y cerebrales son distintas en su forma y función y fabrican diferentes productos. La razón de ello es que sólo parte de la información en los genes se expresa en una determinada célula. Algunos genes son inactivos, otros tienen gran actividad y otros se expresan en distintas ocaciones a lo largo del desarrollo. Por ejemplo en Echerichia coli existen alrededor de 4000 genes, algunos codifican proteínas necesarias para el ciclo de vida (glicolisis), mientras que otros son necesarios para vivir en condiciones especiales de crecimiento (enzima lactasa que degrada la lactosa de la leche).

Normalmente hay dos mecanismos básicos para controlar la actividad metabólica:

a) puede regular la actividad de algunas enzimas (eficiencia)

b) se puede controlar el número de moleculas enzimaticas (cantidad)


Francois Jacob y Jacques Monod en 1961 demostraron la regulación génica y propusieron la existencia del Operon como unidad de regulación de la transcripción.
Una bacteria sometida a un medio con glucosa, incorpora este nutriente para realizar la respiración celular. En ausencia de glucosa y presencia de lactosa en el medio, se incrementa la sintesis de dos enzimas, la lactasa y la beta-galactosidasa. La lactasa rompe la lactosa en glucosa y galactosa, mientras que la beta-galactosidasa transforma la galactosa en glucosa. De esta manera en presencia unicamente de lactosa, la celula se las arregla para producir glucosa para su respiración celular.
Muchos genes se caracterizan por tener una secuencia Operador (O), una secuencia promotora (P) y luego el gen. El operador puede unir una proteína represora que bloquea al promotor. El promotor permite la unión de la enzima RNA polimerasa para permitir la transcripción en el sitio de inicio.
Operon Lactosa (E. coli): La lactosa actúa como molécula inductora, es decir, un sistema apagado se enciende.
a) Ausencia de lactosa y presencia de glucosa en el medio
Sin Lactosa, una proteína Represora se une al operador libremente bloqueando al promotor e impide la unión de la RNA-polimerasa a este sitio, y por lo tanto no se transcriben los genes beta-galactosidasa, permeasa y trasacetilasa, necesarios para tratar a la lactosa.
b) Presencia de Lactosa y ausencia de glucosa en el medio
La permeasa permite el transporte de la lactosa a través de la membrana hacia el citoplasma. Una vez adentro la lactosa se une al represor para cambiar su conformación y lo suelta del sitio operador, desbloqueando así el promotor y permitiendo que la RNA polimerasa se una a este y transcriba los genes beta-galactosidasa, permeasa y transacetilasa. La beta-galactosidasa cumple la función para la cual fue sintetizada, transformar la galactosa en glucosa.
Operon Triptofano (Salmonella tiphi). El triptofano es una molecula represible, es decir, un sistea encendido lo apaga.
a) En presencia de Triptofano (co-represor), este aminoácido se une a una proteína represora inactiva y la convierte en activa. El represor y el co-represor se unen a su sitio operador y bloquean el promotor, impidiendo la unión de la RNA polimerasa e impidiendo además la transcripción de 5 genes de este Operón.
b) En ausencia de Triptofano, el represor queda inactivo y los 5 genes se transcriben normalmente por la RNA polimerasa.

miércoles, 10 de junio de 2009

Maduración del ARNm en eucariontes

Una vez que se ha sintetizado el ARNm, en las celulas eucarioticas, esta molécula sufre una serie de modificaciones dentro del núcleo, antes de ser transportado al citoplasma. Este proceso se denomina maduración del ARNm y consiste en la eliminación de segmentos de ARNm que no participan en la síntesis de proteínas. Estos segmentos denominados INTRONES, son eliminados por enzimas especiales dentro del núcleo.
Los segmentos de ARN que participan en la síntesis de proteínas se llaman EXONES, y son unidos entre sí por un conjunto de enzimas presentes también en el núcleo celular. Por lo tanto este proceso consiste en el corte de intrones y el empalme de exones, lo que determina que la molecula de ARNm recién transcrita (ARNhn), sea más larga que la molécula de ARNm maduro. El proceso de corte y empalme se desarrolla mediante un mecanismo de splicing, en presencia de un complejo formado por proteínas y ARN, llamado speisosoma.

Modificaciones post-transcripcionales

Antes que el ARNm salga del núcleo, debe ser modificado quimicamente en sus extremos para no ser degradado por las enzimas ARNasas del citoplasma. Las modificaciones son: un 7-metilguanina (CAP) en el extremo 5` y una poliadenilación o polyA ( 150 a 200 nucleotidos de adenina: AAAAAAAA) en el extremo 3`. En la foto se observa el CAP.

La Aminoacil-ARNt sintetasa

En una serie de reacciones movidas por la energía producida en la hidrólisis del ATP, las aminoacil-ARNt sintetasa catalizan la unión de los aminoácidos a ARNt específicos, cuyo efecto es el empaquetamiento de los aminoácidos para su correcta colocación en la cadena polipeptídica.
Específicamente, la Aminoacil transferasa toma un aminoácido y un ATP, le une un AMP y libera un Pirofosfato (PPi), luego toma el ARNt y lo intercambia por el AMP que es liberado.

martes, 2 de junio de 2009

El Código genético es universal

El código genético esta compuesto de 64 tripletes, tres de los cuales son secuencias de terminación que no codifican para ningún aminoácido (UAA, UAG y UGA).
Muchos de los tripletes codifican para un mismo aminoácido, por lo cual se le denomina un "Código degenerado", es como si en un supermercado diferentes codigos de barra significan un mismo producto. La secuencia AUG suele ser el primer codón en muchas proteinas en eucariontes.

martes, 5 de mayo de 2009

Severo Ochoa, un brillante científico Español

En 1955 Severo Ochoa descubrió y aisló una enzima de una célula bacteriana de Escherichia coli, que él denominó polinucleótido-fosforilasa y que luego fue conocida como ARN-polimerasa, cuya función catalítica es la síntesis de ARN (ácido ribonucleico), la molécula necesaria para la síntesis de proteínas.

Con esa enzima, Ochoa consiguió por vez primera la síntesis del ARN en el laboratorio, a partir de un sustrato adecuado de nucleótidos (sus componentes elementales). Un año más tarde, el bioquímico norteamericano Arthur Kornberg, discípulo de Ochoa, demostró que la síntesis de ADN también requiere otra enzima polimerasa, específica para esta cadena. Ambos compartieron el Premio Nobel de Fisiología y Medicina de 1959 por sus descubrimientos.

Estos extraordinarios hallazgos permitieron posteriormente el desciframiento del código genético (que se comprobó era universal para todos los seres vivos) y la confirmada capacidad reproductiva de los ácidos nucleicos hizo que éstos fueran ya considerados como las moléculas de la herencia biológica.

Posteriormente, vista la importancia biológica de la doble hélice de ADN, Watson y Crick compartieron el Premio Nobel de Fisiología y Medicina de 1963. Severo Ochoa continuó investigando el mecanismo molecular de la lectura del mensaje genético y su expresión. En 1971 fue nombrado Director del Laboratorio de Biología Molecular de la Universidad Autónoma de Madrid. Dejó la Universidad de Nueva York en 1975, regresó a su país de origen y en la década de 1980 dirigió dos grupos de investigación en biosíntesis de proteínas simultáneamente, uno en el Instituto de Biología Molecular de Madrid y otro en el Roche Institute of Molecular Biology de Nueva Jersey, en Estados Unidos, hasta que en 1985 fijó su residencia definitivamente en España. Aunque se jubiló oficialmente en 1975, nunca abandonó la investigación.

En mayo de 1986 murió su mujer, y ello supuso para Severo un golpe muy duro que le sumergió en una especie de profunda depresión. A partir de entonces, Ochoa decidió no volver a publicar ningún trabajo científico más, con lo que puso totalmente fin a su brillante carrera. En 1993 murió en Madrid, a la edad de 88 años, a consecuencia de una neumonía.

George Gamow, un físico excepcional que aportó en la Biología.

Nacionalizado Norteamericano pero de origen Ruso. Fue el primer fisico que creó una teoría para la desintegración alfa y ayudó a explicar la desintegración Beta; explicó conductas de elementos radiactivos, como el "efecto tunel". Hizo investigaciones en astrofisica y cosmología. Fue el primero en calcular modelos de estrellas con reacciones termonucleares. Fue uno de los primeros en sugerir la teoría del universo caliente (hot-Universe) que predecia la existencia de una radiación de fondo formado por el Big-Bang (ideas confirmadas por Arno Penzias y Robert Wilson). En 1954, ayudó a decifrar un problema teorico al probar que 4 tipos diferentes de bases combinadas en tripletes, producian 64 combinaciones (4 elevado a 3), suficiente para almacenar información hereditaria y codificar los 20 aminoácidos existentes. En 1968, Her Khorana, Robert Holley y Marshall Nirenberg recibieron el premio Nobel al decifrar el codigo genético y nunca se mencionó a Gamow. Murió en Agosto de 1968.

lunes, 4 de mayo de 2009

Transcripción

a) Para que ocurra la transcripción debe haber una enzima compleja (con muchas subunidades), la ARN polimerasa que reconoce un sitio característico el "sitio de inicio". La ARN polimerasa se une a la hebra de ADN que será transcrita en un segmento llamado "Promotor". Una vez unido al promotor, sale una subunidad sigma y comienza la transcripción uniendo un rNTPs (ribonucleotido tri fosfatos) y luego rNMPs generando el ARN en una molecula hibrida de 10 a 12 nucleotidos.

b) La elongación de la cadena de ARN continúa abriendo la doble helice y alargando la cadena.

c) Para terminar, la ARN polimerasa reconoce un "sitio de terminación", el cual al ser leído se forma una hebra capaz de plegarse consigo misma, formando una horquilla que permite el desensamblaje de la polimerasa y el ARN. Además entra una subunidad "ro" que es un requisito adicional para el desarme y liberación del ARN.

Procesos estudiados

La Replicación es el proceso de copiar exactamente el ADN
La Transcripción es el proceso de copiar un gen del ADN en forma de una molécula de ARN, el cual saldrá del núcleo.
El Procesamiento de ARN, es el proceso en el cual se modifica el ARN para no ser degradado en el citoplasma por ARNasas.
La Traducción es el proceso en que se lee el ARN para sintetizar la proteína correspondiente en el ribosoma citoplasmatico o unido al RER.

ADN Polimerasa III

Proceso por el cual una molécula de ADN se copia; duplica su información
Este proceso parte de una hebra de ADN y genera una hebra complementaria
La replicación es semiconservativa: Cada hebra genera una complementaria nueva
Es realizada por proteínas
Necesita:

  • dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)
  • ADN Molde
  • Enzima ADN Polimerasa (3 tipos en procariontes y 5 en eucariontes)
  • Helicasa (Desenrrollasa)
  • Topoisomerasas (DNAgirasa)
  • Ligasas
  • Proteínas reparadoras de errores (ADN pol reparadoras y otras 50 proteínas)

El enzima que realiza la replicación es la ADN polimerasa.
Tiene unos 1000 aa con lugares para ADN molde, cebador (ARN o ADN ya formado) y dNTP.

Genera una hebra de ADN complementario que crece de 5´a 3´

  • ADN pol se une a una hebra de ADN molde
  • Busca un desoxirribonucleótido trifosfato complementario al de la base del ADN situda en el sitio del dNTP
  • Lo une a la cadena de desoxirribonucleótidos anterior
  • Avanza una posición y repite el proceso indefinidamente


ADN plimerasa

Una cadena crece más rápido por ser posible avanzar en el sentido 5->3´de manera continua, mientras que la otra debe interrumpirse y volver a comenzar

En realidad el proceso es más complejo que el descrito puesto que la ADN pol nunca inicia la síntesis de ADN a partir de una cadena sencilla de ADN sino que necesita un híbrido de ADN-ARN (primer) de doble cadena para comenzar. Este híbrido es generado por la ARN polimerasa (primasa). Tras la replicación ha de eliminarse el ARN, sustituirse por ADN y unir la cadena.

Replicación del ADN

La replicación del ADN necesita de un complejo grande de moleculas que a continuación se describen en la horquilla de replicación:

a) La hebra principal (hebra lider) necesita una ADN polimerasa III (Pol III) para polimerizar una hebra en dirección 5`-3`. Esta polimerasa toma los dNTPs (nucleotidos trifosfatos) les saca un pirofosfato (p-p) y los coloca como dNMP (nucleotidos monofosfatos). Las subunidades de la pol III polimerizan y chequean que la unión de los nucleotidos sea correcta. Si hay un error corrige inmediatamente el nucleotido mal instalado.

b) La hebra opuesta (hebra retardada) no puede ser polimerizada de la misma forma porque la enzima debería funcionar de 3`a 5` y esto no lo hace, sólo de 5`a 3. La solución llegó de un Japones Reiji Okazaki, quien descubrio que la hebra opuesta se sintetizaba en segmentos (que hoy llevan su nombre, "fragmentos de Okazaki"). Estos se forman porque la "RNA primer" o "primasa" crea un "primer" o "partidor" de ARN de 10 nucleotidos aproximadamente, en donde se sujeta la DNA polimerasa III de manera invertida para dicha hebra, es decir, de 5`a 3`.

c) Una vez que se polimeriza de manera invertida, pol III choca con el próximo "primer". La polimerasa I reemplaza el primer de ARN por segmentos de ADN.

d) Los partidores en ADN y la polimerización de ADN (fragmentos de Okasaki) son unidos por otra enzima, la ADN ligasa.

e) Las proteinas DBP (DNA binding protein) permiten tener abiertas las hebras sin que estas se junten mientras ocurre la replicación.

f) La ADN girasa, abre la doble hebra haciendo cortes, girando las hebras y ligando nuevamente las hebras cortadas.

sábado, 21 de marzo de 2009

Expresión de los genes a Proteína



Gen = Son secuencias específicas de bases nitrogenadas que llevan una información capaz de codificar una proteína. Los genes son la unidad de herencia, segregación, mutación y recombinación en los seres vivos.

Genotipo = Son las características genéticas a nivel molecular, que se representa como la secuencia particular de bases nitrogenadas que codifican una proteína.

Fenotipo = Son los rasgos observables, producto de la expresión génica en forma de proteínas y que determinan una forma, una función, una estructura, o cualquier rasgo diferenciable de otros. Ejemplo son los dedos de la mano, la forma del riñón, el color de ojos, etc.